ADN-ja rekombinante janë molekula të formuara nga teknikat laboratorike të rikombinimit gjenetik për të kombinuar materialin gjenetik nga burime të shumta. Është e mundur sepse molekulat e ADN-së të të gjithë organizmave kanë të njëjtën strukturë kimike dhe ndryshojnë vetëm në sekuencën nukleotide brenda saj.
Krijimi
Klonimi molekular është një proces laboratorik që përdoret për të krijuar ADN-në rekombinante. Është një nga dy metodat më të përdorura, së bashku me reaksionin zinxhir polimerazë (PCR). Kjo ju lejon të kontrolloni replikimin e çdo sekuence të veçantë të ADN-së të zgjedhur nga eksperimentuesi.
Ka dy dallime themelore midis metodave të ADN-së rekombinante. Njëra është se klonimi molekular përfshin replikimin në një qelizë të gjallë, ndërsa PCR përfshin in vitro. Një ndryshim tjetër është se metoda e parë lejon prerjen dhe ngjitjen e sekuencave të ADN-së, ndërsa e dyta përmirësohet duke kopjuar rendin ekzistues.
ADN vektoriale
Marrja e ADN-së rekombinante kërkon një vektor klonimi. Ai rrjedh nga plazmidet ose viruset dhe është një segment relativisht i vogël. Zgjedhja e vektorit për klonimin molekular varet nga zgjedhja e organizmit pritës, madhësia e ADN-së që do të klonohet dhe nëse molekulat e huaja duhet të shprehen. Segmentet mund të kombinohen duke përdorur metoda të ndryshme si klonimi me enzimë/ligazë kufizuese ose montimi i Gibson.
Klonim
Në protokollet standarde, klonimi përfshin shtatë hapa.
- Zgjidh organizmin pritës dhe vektorin e klonimit.
- Marrja e një vektori të ADN-së.
- Formimi i ADN-së së klonuar.
- Krijimi i ADN-së rekombinante.
- Futja e tij në organizmin pritës.
- Përzgjedhja e organizmave që e përmbajnë atë.
- Përzgjedhja e kloneve me futjet e dëshiruara të ADN-së dhe vetitë biologjike.
Pas transplantimit në organizmin pritës, molekulat e huaja që përmbahen në konstruktin rekombinant mund të shprehen ose jo. Shprehja kërkon ristrukturimin e gjenit për të përfshirë sekuencat që janë të nevojshme për prodhimin e ADN-së. Ai po përdoret nga makina e përkthimit të hostit.
Si funksionon
ADN-ja rekombinante funksionon kur qeliza pritëse shpreh një proteinë nga gjenet rekombinante. Shprehja varet nga rrethimi i gjenit me një sërë sinjalesh që ofrojnë udhëzime për transkriptimin e tij. Ato përfshijnë promotorin, lidhjen e ribozomit dhe terminatorin.
Problemet lindin nëse gjenipërmban introne ose sinjale që veprojnë si terminatorë për bujtësin bakterial. Kjo çon në ndërprerje të parakohshme. Proteina rekombinante mund të përpunohet, paloset ose degradohet në mënyrë jo të duhur. Prodhimi i tij në sistemet eukariote zakonisht ndodh në maja dhe kërpudha filamentoze. Përdorimi i kafazeve të kafshëve është i vështirë për shkak të nevojës për një sipërfaqe të fortë mbështetëse për shumë njerëz.
Vetitë e organizmave
Organizmat që përmbajnë molekula të ADN-së rekombinante kanë fenotipe në dukje normale. Pamja, sjellja dhe metabolizmi i tyre zakonisht nuk ndryshojnë. Mënyra e vetme për të demonstruar praninë e sekuencave rekombinante është të ekzaminohet vetë ADN-ja duke përdorur testin e reaksionit zinxhir të polimerazës.
Në disa raste, ADN-ja rekombinante mund të ketë efekte të dëmshme. Kjo mund të ndodhë kur fragmenti i tij që përmban një promotor aktiv ndodhet pranë një gjeni të qelizës pritëse më parë të heshtur.
Përdor
Teknologjia rekombinante e ADN-së përdoret gjerësisht në bioteknologji, mjekësi dhe kërkime. Proteinat e saj dhe produktet e tjera mund të gjenden në pothuajse çdo farmaci perëndimore, klinikë veterinare, zyrë mjeku, laborator mjekësor ose biologjik.
Zbatimi më i zakonshëm është në kërkimin bazë, ku teknologjia është thelbësore për pjesën më të madhe të punës së sotme në shkencat biologjike dhe biomjekësore. ADN-ja rekombinante përdoret për të identifikuar, hartuar dhe renditur gjenet dhe për t'i përcaktuar atofunksione. Sondat rADN përdoren për të analizuar shprehjen e gjeneve në qeliza të vetme dhe në inde të organizmave të tërë. Proteinat rekombinante përdoren si reagentë në eksperimentet laboratorike. Disa shembuj specifik janë dhënë më poshtë.
kimozinë rekombinante
E gjetur në abomasum, kimozina është një enzimë e nevojshme për të bërë djathë. Ishte aditiv i parë ushqimor i modifikuar gjenetikisht i përdorur në industri. Një enzimë rekombinante e prodhuar mikrobiologjikisht, strukturisht identike me një enzimë me prejardhje nga viçi, është më e lirë dhe prodhohet në sasi më të mëdha.
Insulinë humane rekombinante
Insulina e zëvendësuar virtualisht e përftuar nga burime shtazore (p.sh. derrat dhe gjedhët) për trajtimin e diabetit të varur nga insulina. Insulina rekombinante sintetizohet duke futur gjenin e insulinës njerëzore në bakteret e gjinisë Eterichia ose maja.
Hormon i rritjes
Përshkruhet për pacientët, gjëndra e hipofizës së të cilëve nuk prodhon mjaftueshëm hormon të rritjes për të mbështetur zhvillimin normal. Para se të bëhej i disponueshëm hormoni i rritjes rekombinante, ai merrej nga gjëndrra e hipofizës së kufomave. Kjo praktikë e pasigurt ka bërë që disa pacientë të zhvillojnë sëmundjen Creutzfeldt-Jakob.
faktori i koagulimit rekombinant
Kjo është një proteinë e mpiksjes së gjakut që administrohet te pacientët me forma të hemofilisë me çrregullime të gjakderdhjes. Ata nuk janë në gjendje të prodhojnëfaktori VIII në sasi të mjaftueshme. Para zhvillimit të faktorit VIII rekombinant, proteina bëhej duke përpunuar sasi të mëdha të gjakut të njeriut nga dhurues të shumtë. Kjo kishte një rrezik shumë të lartë të transmetimit të sëmundjeve infektive.
Diagnoza e infeksionit HIV
Secila nga tre metodat e përdorura gjerësisht për diagnostikimin e infeksionit HIV u zhvillua duke përdorur ADN-në rekombinante. Një test antitrupash përdor proteinën e saj. Ai zbulon praninë e materialit gjenetik HIV duke përdorur reaksionin zinxhir të polimerazës së transkriptimit të kundërt. Zhvillimi i testit u bë i mundur nga klonimi molekular dhe sekuenca e gjenomit të HIV.
