Kromatografia është një nga metodat për ndarjen e substancave. Përdoret për analiza të mëvonshme cilësore dhe sasiore të vetive fizike dhe kimike të mikrogrimcave. Një variant i kësaj teknologjie është kromatografia e afinitetit. Ideja e diferencimit të përbërjeve proteinike duke përdorur vetinë e afinitetit molekular është e njohur në shkencë për disa dekada. Megjithatë, ajo ka marrë zhvillimin e saj vetëm vitet e fundit, pas futjes së materialeve hidrofile shumë poroze të përdorura si matricë. Kjo metodë mundëson zgjidhjen e problemeve analitike (ndarja e substancave dhe identifikimi i tyre) dhe problemet përgatitore (pastrimi, përqendrimi).
Thelbi
Kromatografia e afinitetit (nga fjala latine affinis - "ngjitur", "i lidhur") bazohet në ndërveprimet e afinitetit, të cilat janë formimi i lidhjeve shumë specifike midis një molekule ndarëse (ligand ose afinant) dhe një molekule të synuar. Këta mekanizma janë të përhapur në natyrë (lidhja e ndërmjetësve ose hormoneve dhe receptorëve, antitrupave dheantigjenet, hibridizimi i polinukleotideve dhe lloje të tjera procesesh). Në mjekësi, kromatografia e afinitetit është përdorur për qëllime praktike që nga viti 1951
Përbërësit ndahen si më poshtë:
- tretësira e punës që përmban substancën që do të izolohet kalohet përmes sorbentit;
- ligandi i depozituar në matricën sorbente ruan këtë substancë;
- është e përqendruar (akumulim);
- nxjerrja e substancës së izoluar nga sorbent duke u larë me një tretës.
Kjo metodë ju lejon të izoloni qeliza të tëra. Dallimi nga kromatografia tradicionale e thithjes është se ekziston një lidhje e fortë biospecifike e përbërësit të izoluar me sorbentin, i cili karakterizohet nga selektiviteti i lartë.
Adsorbentë
Substancat e mëposhtme përdoren si adsorbentë:
- Përbërjet e xhelit të bazuar në agarozë, një polisaharid i marrë nga agari. Më të përdorurat janë 3 varietete: sefaroza 4B, CL (agarozë e ndërlidhur) dhe afi-gel. Përbërja e fundit është një xhel i modifikuar i agarozës dhe poliakrilamidit. Ka inertitet më të madh biologjik, rezistencë të lartë kimike dhe termike.
- Silicë (xhel silicë).
- Glass.
- Polimere organike.
Për të eliminuar pengesat mekanike gjatë kontaktit të ligandit, përdoren substanca shtesë për ta ndarë atë nga transportuesi (peptide, diamina, poliamina, oligosakaride).
Pajisje
Pajisja e kromatografisë afiniteti përfshin njësitë kryesore të mëposhtme:
- depozita magazinimi për fazën e lëvizshme (eluent);
- pompa me presion të lartë për furnizim të mesëm (më shpesh reciproke);
- filtër për pastrimin e eluentëve nga pluhuri;
- pajisje dozuese;
- kolona kromatografike për ndarjen e përzierjes;
- detektor për zbulimin e komponentëve të ndarë që largohen nga kolona;
- regjistruesit kromatogram dhe njësia mikroprocesorike (kompjuter).
Në mënyrë që të zvogëlohet sasia e ajrit të tretur, helium fillimisht kalon nëpër fazën e lëvizshme. Për të ndryshuar përqendrimin e eluentit, janë instaluar disa pompa të kontrolluara nga programuesi. Kolonat kromatografike janë prej çeliku inox (për kërkesat e shtuara për rezistencë ndaj korrozionit), qelqi (opsioni universal) ose akrilik. Për qëllime përgatitore, diametri i tyre mund të variojë nga 2 deri në 70 cm. Në kromatografinë analitike përdoren mikrokolona Ø10-150 μm.
Për të rritur ndjeshmërinë e detektorëve, në përzierje futen reagentë, të cilët kontribuojnë në formimin e substancave që thithin më shumë rreze në zonën ultravjollcë ose të dukshme të spektrit.
Metodologji
Ka 2 lloje kryesore të kromatografisë së afinitetit të lëngët:
- Kollona, në të cilën kolona është e mbushur me një fazë të palëvizshme dhe një përzierje kalohet përmes saj me një rrjedhjeeluent. Ndarja mund të ndodhë nën presion ose nën gravitet.
- Shtresë e hollë. Eluenti lëviz përgjatë shtresës së sheshtë adsorbuese nën ndikimin e forcave kapilare. Adsorbent aplikohet në një pjatë qelqi, shufër qeramike ose kuarci, fletë metalike.
Fazat kryesore të punës përfshijnë:
- përgatitja e adsorbentit, fiksimi i ligandit në bartës;
- ushqyerja e përzierjes së ndarjes në kolonën kromatografike;
- ngarkimi i fazës së lëvizshme, lidhja e komponentit nga ligandi;
- ndërrimi i fazës për të izoluar substancën e lidhur.
Destinacioni
Kromatografia e afinitetit përdoret për të izoluar llojet e mëposhtme të substancave (lloji i ligandit të përdorur tregohet në kllapa):
- analoge të frenuesve enzimatikë, substrateve dhe kofaktorëve (enzimave);
- substanca bioorganike me shenja të huajshmërisë gjenetike, viruse dhe qeliza (antitrupa);
- karbohidrate me peshë të lartë molekulare, polimere monosakaride, glikoproteina (lektina);
- proteinat nukleare, nukleotidiltransferazat (acidet nukleike);
- receptorët, proteinat transportuese (vitamina, hormone);
- proteinat që ndërveprojnë me membranat qelizore (qelizat).
Kjo teknologji përdoret gjithashtu për të marrë enzima të imobilizuara dhe lidhja e tyre me celulozën lejon prodhimin e imunosorbentëve.
Kromatografia e proteinave që lidhin ADN
Izolimi i proteinave që lidhin ADN-në kryhet duke përdorurheparina. Ky glikozaminoglikan është i aftë të lidh një gamë të gjerë molekulash. Kromatografia e afinitetit të proteinave të këtij grupi përdoret për të izoluar substanca të tilla si:
- faktorët e fillimit dhe zgjatjes së përkthimit (sinteza e molekulave dhe proteinave të acidit nukleik);
- restriktazat (enzimat që njohin sekuenca të caktuara në ADN-në me dy zinxhirë);
- Ligazat dhe polimerazat e ADN-së (enzimat që katalizojnë bashkimin e dy molekulave për të formuar një lidhje të re kimike dhe përfshihen në replikimin e ADN-së);
- frenuesit e proteazës së serinës që luajnë një rol të rëndësishëm në proceset imune dhe inflamatore;
- faktorët e rritjes: fibroblasti, Schwann, endotelial;
- proteinat e matricës jashtëqelizore;
- receptorët hormonal;
- lipoproteina.
Dinjiteti
Kjo metodë është një nga më specifiket për izolimin e përbërjeve reaktive (enzimave dhe agregateve më të mëdhenj - viruseve). Megjithatë, ai përdoret jo vetëm për të izoluar substanca biologjikisht aktive.
Zbulimi i antitrupave në sasi të vogla, vlerësimi sasior i acidit poliadenilik, përcaktimi i shpejtë i masave molekulare të dehidrogjenazave, largimi i disa ndotësve, studimi i kinetikës së aktivizimit të formës joaktive të tripsinës, strukturës molekulare të njeriut. interferonet – kjo nuk është e gjithë lista e studimeve në të cilat përdoret afiniteti.kromatografia. Përdorimi në klinikë është për shkak të avantazheve të tij si:
- Mundësi pastrimi efektiveproteinat, polisaharidet, acidet nukleike. Ato ndryshojnë pak në vetitë e tyre fizike dhe kimike dhe humbasin aktivitetin gjatë hidrolizës, denatyrimit dhe llojeve të tjera të trajtimit të përdorur në metoda të tjera.
- Shpejtësia e ndarjes së substancave, natyra dinamike e procesit.
- Nuk ka nevojë për pastrim special enzimë dhe homogjenizim izoenzim për të përcaktuar konstantet e disociimit.
- Në gjendje të ndajë një gamë të gjerë substancash.
- Konsum i ulët i ligandëve.
- Mundësia e ndarjes së substancave në vëllime të mëdha.
- Procesi i kthyeshëm i lidhjes së makromolekulave biologjike.
Kjo teknikë mund të kombinohet me të tjera, për të imponuar një fushë shtesë (gravitacionale, elektromagnetike). Kjo ju lejon të zgjeroni aftësitë teknike të kromatografisë.
Inxhinieri enzimatike
Falë kësaj metode, filloi zhvillimi aktiv i një dege të re të bioteknologjisë - inxhinieria e enzimave.
Kromatografia e afinitetit për izolimin e enzimës ka përparësitë e mëposhtme:
- marrja e enzimave në sasi të mëdha si rezultat i më pak kohe, si rezultat - zvogëlimi i tyre në çmim;
- immobilizimi i enzimave mund të zgjerojë ndjeshëm fushën e zbatimit të tyre në mjekësi dhe industri;
- Lidhja e enzimave me një suport të ngurtë të patretshëm bën të mundur studimin e ndikimit të mikromjedisit dhe drejtimit të reaksioneve, të cilat luajnë një rol të rëndësishëm në proceset natyrore dhe fiziologjike.
