PCR, ose reaksioni zinxhir i polimerazës, është një teknikë e sofistikuar laboratorike që përdoret gjerësisht në mjekësi dhe fusha të tjera shkencore. Diagnostifikimi PCR në një kohë u bë një zbulim i vërtetë në shkencë.
Përshkrim
PCR sasiore është një lloj PCR në kohë reale.
Kjo kuptohet si një variant i PCR, në të cilin kinetika e reaksionit regjistrohet vazhdimisht, gjë që bën të mundur vlerësimin cilësor të përmbajtjes së sekuencave specifike nukleotide të ADN-së në një përzierje molekulare komplekse.
Metoda sasiore PCR do të diskutohet më në detaje më poshtë.
Thelbi i analizës
Metodat kulturore dhe serologjike përdoren veçanërisht shpesh për të diagnostikuar infeksionet. Nën të parën, përcaktohen antitrupat ndaj një patogjeni infektiv në serumin e gjakut. Në të dytën, materiali biologjik i marrë nga një person i sëmurë përdoret për të mbjellë një medium specifik që është i favorshëm për rritjen e kolonive patogjene. Diagnostifikimi në të dyjarasti mund të zgjasë ditë ose javë.
Ekzaminimi PCR mund të kryhet me materiale të ndryshme biologjike që merren nga një person i sëmurë. Gjaku dhe mediumet dhe lëngjet e tjera patologjike, fiziologjike dhe biologjike veprojnë si mostra. Ju mund të bëni feces ose urinë PCR.
Infeksionet atipike dhe virale më së shpeshti diagnostikohen me PCR sasiore, pasi mund të mos jenë të lehta për t'u diagnostikuar për shkak të natyrës specifike të procesit patologjik të provokuar prej tyre. Për të përcaktuar infeksione të tilla, duhet kohë, gjatë së cilës në trup fillojnë të prodhohen antitrupa, të përcaktuar me metoda serologjike. Por kjo është e papranueshme në disa raste.
Metoda e kryerjes
Metoda PCR - zbulimi laboratorik i infeksionit në mostrat e izoluara nga pacienti (in vitro).
Për të kryer një reaksion zinxhir polimerazë, kërkohet një grup reagentësh të veçantë.
Materiali testues futet në epruveta me reagentë. Tubat e provës vendosen në një aparat të veçantë - një përforcues PCR, i cili është krijuar për të përforcuar (rritur numrin) e fragmenteve të ARN-së ose ADN-së së dëshiruar, amplifikuesi PCR funksionon në një mënyrë ciklike. Në çdo cikël, nëse mostrat përmbajnë sekuencën e ARN-së ose ADN-së të patogjenit, atëherë gjithnjë e më shumë kopje të grimcave të këtyre acideve nukleike grumbullohen në tretësirë. Ju mund të përcaktoni praninë e patogjenit dhe sasinë e tij në mostra.
Llojet e PCR
Analiza cilësore me PCR ju lejon të merrni rezultatin e mëposhtëm:
- negativ kur patogjeni me interes nuk gjendet në mostra;
- pozitive nëse në mostrat gjenden sekuenca që janë karakteristike për një patogjen të caktuar.
Me një rezultat pozitiv PCR, mund të flasim me 95% saktësi për praninë e një infeksioni të diagnostikuar. Në të njëjtën kohë, saktësia e grupeve PCR të përdorura për qëllime diagnostikuese arrin 100%.
Zakonisht 5% e rezultateve të pasakta përcaktohen nga faktori njerëzor. Për shembull, shkeljet e teknikës së analizës dhe ruajtjes së reagentëve mund të ulin ndjeshëm saktësinë e studimit.
PCR sasiore përcakton konceptin e ngarkesës virale. Është e mundur të përcaktohet se sa grupe të ADN-së patogjene ishin në mostrat e marra nga pacienti.
Ashpërsia e infeksionit është drejtpërdrejt proporcionale me rritjen e numrit të tyre. Ju gjithashtu mund të përcaktoni suksesin e terapisë për të reduktuar ngarkesën virale.
Dorëzimi për biomaterial PCR
PCR sasiore kryhet në klinikë, kryesisht në mëngjes. Gjatë një vizite te mjeku, pacientit do t'i thuhet se çfarë duhet të merret: kruarje, njolla, urinë ose gjak. PCR mund të zbulojë patogjenë pavarësisht nga niveli i kontaminimit të materialit.
Për një analizë pozitive, teorikisht, kërkohet prania e vetëm një patogjeni në mostra. Në praktikë, ata përpiqen të krijojnë kushte edhe më të favorshme. Ka disa rekomandime për këtë:
- nëse marrin një kruarje ose shtupë nga organet gjenitaleorganeve, duhet të përmbaheni nga marrëdhëniet intime tre ditë para studimit;
- nuk mund të laheni me barna antibakteriale ose të laheni përpara analizës;
- tre orë para se të bëni një njollë nga uretra, duhet të jeni të durueshëm dhe të mos zbrazni zorrët.
Mos i ndiqni këto rregulla kur dhuroni gjak.
Si interpretohen rezultatet e analizës sasiore PCR?
Vlerësimi sasior i rezultateve të marra
Në një sërë situatash klinike, shfaqet problemi i efektivitetit të trajtimit dhe/ose dinamikës së procesit patologjik. Pyetje të tilla janë veçanërisht të rëndësishme kur ekzaminohen njerëzit me infeksione kronike (virusi i mungesës së imunitetit të njeriut, hepatiti B dhe C). Gjatë diagnostikimit, ato bazohen në faktin se akumulimi i amplikoneve (produkteve PCR) është proporcional me praninë e kopjeve të gjenit të dëshiruar në kampionin e analizuar.
Sigurisht, duke marrë parasysh rezultatet e PCR sasiore bëhet me elektroforezë xhel me studimin e intensitetit të sinjaleve të veçanta PCR. Gjithashtu, një parakusht për një vlerësim të saktë sasior të rezultateve të marra janë mostrat pozitive të kontrollit të besueshëm që përmbajnë një numër të njohur kopjesh të gjenit të dëshiruar (për shembull, një mijë kopje të gjenit të hepatitit C për një reagim PCR). Disa hollime serike të kontrollit sasior lejojnë krijimin e kurbave të kalibrimit dhe përdoren për të vlerësuar përmbajtjen e gjenokopive klinike në ekzemplarët klinikë.
Në përkufizimin e PCR sasiore, një arritje kryesore ka qenë krijimiSondat fluoreshente të ADN-së që i shtohen përzierjes së reaksionit njëkohësisht me primerë të thjeshtë dhe ju lejojnë të gjurmoni procesin e PCR në kohë, domethënë PCR në kohë reale.
Metodologjia TaqMan i referohet sintezës së sondave fluoreshente të ADN-së që janë specifike për pjesën e mesme të amplikonit dhe kanë dy etiketa në skajet. Njëra prej tyre është një etiketë fluoreshente, e dyta është një molekulë shuarëse për këtë fluoreshencë.
Një pajisje speciale, e cila është një hibrid i një fluorimetri dhe një amplifikuesi termobllok, bën matje konstante të fluoreshencës në çdo epruvetë (parimi PCR në kohë reale). Pas 20-40 cikleve të PCR, do të përftohen kurba individuale për çdo mostër. Numri i kopjeve të gjenit të dëshiruar që përmbahet në kampionin e provës mund të llogaritet nga kthesat e kalibrimit me mostrat e kontrollit.
Gjithashtu, një veçori e rëndësishme e zbatimit të PCR me metodën fluoreshente është se nuk ka nevojë të hapen tuba me një përzierje PCR kur merren parasysh rezultatet. Kjo zvogëlon mundësinë e ndotjes së dhomës me produkte përforcuese dhe nuk ka nevojë të ndahen zona të veçanta pune për elektroforezë.
Çfarë tregon një transkriptim sasior PCR?
Çfarë po zbulohet?
Nëpërmjet një metode të tillë si PCR sasiore, konstatohen ndryshime cilësore në gjene: insertime, delecione dhe mutacione pikësore. Por me disa çrregullime trashëgimore, simptomat përkatëse shfaqen si përgjigje ndaj një ndryshimi në përmbajtjen e gjeneve të caktuara.
FaleminderitAnaliza sasiore jep një rezultat numerik, më shpesh në IU / ml. Kjo do të thotë se në një mililitër të mostrës së provës është gjetur një numër i caktuar kopjesh të ARN-së ose ADN-së së patogjenit, të matura në njësi ndërkombëtare.
Në varësi të madhësisë, diagnostikohet ashpërsia e infeksionit. Gjaku zakonisht testohet për të përcaktuar ngarkesën virale, pasi viruset lëvizin lirshëm në gjak gjatë sëmundjes.
Karakteristikat
PCR sasiore në një test gjaku ka dy veçori.
- Analiza kryhet në prani të primerëve ose trifosfateve deoksiribonukleozide, të cilat janë etiketuar me një etiketë fluoreshente ose radioaktive për të përcaktuar me saktësi përmbajtjen e produktit të PCR të formuar.
- Në procesin e PCR, përfundoni reagimin herët përpara se të shfaqen shumë produkte PCR. Kjo për faktin se në fazën përfundimtare të ngopjes, kur ka shumë produkte PCR, si vetë enzima ashtu edhe substratet veprojnë si lidhje kufizuese të këtij reagimi. Fundi i ciklit të ardhshëm të PCR në kushte të tilla nuk karakterizohet më nga dyfishimi i numrit të produkteve të PCR, nivelohen diferenca sasiore të parëndësishme midis mostrave të ndryshme, të cilat përcaktohen mjaft qartë në fazat e hershme pas kalimit nëpër një seri ciklesh reagimi..
Kostoja e diagnostikimit PCR
Kërkimi PCR ka një kosto, e cila varet nga lloji i infeksionit që do të testohet, nga metodologjia e analizës dhe materiali i testimit. Për të përcaktuar një infeksion, do të duhet të jepni brenda200-800 rubla. Shtohet gjithashtu një tarifë për marrjen e biomaterialit - afërsisht 400 rubla.
