Citometria e rrjedhës është një metodë kërkimore citologjike e përdorur për analizën e thellë të qelizave. Avantazhi i tij është se ju lejon të studioni secilën qelizë individualisht. Ky lloj analize ndihmon për të vlerësuar disa parametra në qindra qeliza në disa sekonda. Si rezultat, citofluorimetria konsiderohet si një nga metodat më të shpejta dhe më të sakta të analizës që aktualisht disponohen nga shkencëtarët dhe klinicistët.
Parimi
Parimi i citometrisë së rrjedhës bazohet në matjen e shpërndarjes së dritës dhe lumineshencës (fluoreshencës) të qelizave. Pezullimi i qelizave kalohet në formë rryme me shpejtësi të madhe nëpër qelizën e citometrit, ku rrezatohet me lazer. Aty kryhet edhe i ashtuquajturi fokusim hidrodinamik. Mekanizmi i tij është që rrjedha nga qeliza me grimcat e studiuara në dalje derdhet në rrymën e jashtme, e cila ka një shpejtësi më të lartë. Si rezultat, grimcat radhiten në një zinxhir të renditur.
Paraqelizat janë etiketuar me ngjyra të veçanta fluoreshente (fluorokrome). Falë tyre, rrezja lazerngacmon një shkëlqim dytësor. Sinjalet e marra të dritës regjistrohen nga detektorët. Më pas, informacioni përpunohet duke përdorur algoritme softuerësh që ju lejojnë të numëroni popullatat individuale të qelizave që ndryshojnë në disa kritere.
Kërkimet me mikroskopi konvencionale shpesh nuk arrijnë të bëjnë dallimin midis qelizave të ndryshme sepse ato duken njësoj. Citofluorimetria mund të sigurojë të dhëna të tjera (integritetin e strukturës së ADN-së), të analizojë shprehjen e proteinave, mbijetesën e qelizave.
Meqenëse ngacmimi i fluorokromeve kërkon rreze drite me gjatësi vale të ndryshme, si dhe lloje të ndryshme detektorësh, instalimet moderne janë të pajisura me disa kanale zbulimi (nga 4 në 30). Numri i emetuesve të lazerit mund të jetë nga 1 në 7. Pajisjet më komplekse lejojnë studime me shumë parametra të disa vetive të grimcave në të njëjtën kohë.
Avantazhet dhe disavantazhet
Përfitimet e citometrisë së rrjedhës përfshijnë:
- shpejtësi e lartë përpunimi (regjistrimi deri në 30 mijë ngjarje në 1 sekondë);
- mundësia për të studiuar një numër të madh qelizash (deri në 100 milionë në një mostër);
- Përcaktimi sasior i intensitetit të dritës fluoreshente;
- analizë e secilës qelizë;
- studim i njëkohshëm i proceseve heterogjene;
- ndarja automatike e të dhënave sipas popullatave qelizore;
- vizualizimi cilësor i rezultateve.
Një veçori tjetër e kësaj teknologjie është ajogrimca e analizuar mund të ngjyroset me disa tretësirë fluoreshente. Falë kësaj, ndodh një studim me shumë parametra.
Dizavantazhet përfshijnë kompleksitetin e pajisjeve teknike dhe nevojën për përgatitje speciale të mostrës.
Citometra
Pajisjet e para të këtij lloji u shfaqën tashmë në vitin 1968 në Gjermani, por ato u përhapën shumë më vonë. Aktualisht, të gjitha pajisjet që punojnë me metodën e citometrisë së rrjedhës mund të ndahen në 2 lloje:
- pajisje që matin rrezatimin fluoreshent (dy ose më shumë gjatësi vale), shpërndarjen e dritës 10° dhe 90° (detektor me kënd të ulët dhe shpërndarje anësore);
- pajisje që, përveç matjes së disa parametrave celularë, renditen automatikisht në grupe sipas këtyre kritereve.
Detektori i shpërndarjes përpara është projektuar për të përcaktuar madhësinë e qelizës dhe pajisja e shpërndarjes anësore ju lejon të merrni informacion në lidhje me praninë e granulave ndërqelizore, raportin e vëllimit të citoplazmës dhe bërthamës.
Citometrat klasikë, ndryshe nga mikroskopët e dritës, nuk lejojnë marrjen e një imazhi të një qelize. Sidoqoftë, vitet e fundit janë zhvilluar pajisje të kombinuara që janë në gjendje të kombinojnë aftësitë e një mikroskopi dhe një citofluorimetri. Ato do të diskutohen më poshtë.
Citometra imazherike
Për instrumentet e përdorura në citometrinë klasike të rrjedhës,Një veçori është karakteristike: nëse ngjarje të rralla regjistrohen në popullatën e qelizave të analizuara, atëherë nuk ka asnjë mënyrë për të vlerësuar se cili është thelbi i tyre. Këto grimca mund të jenë ose mbetje të qelizave të vdekura ose një grup i rrallë i tyre. Në pajisjet konvencionale, të dhëna të tilla përjashtohen nga rrjedha e përgjithshme e ngjarjeve, por janë ato që mund të kenë vlerë të veçantë për analizat shkencore dhe klinike.
Gjenerata e re e citometrave të rrjedhës imazherike ju lejon të kapni një imazh të çdo qelize që kalon në rrjedhën përmes zonës së detektorit. Është e lehtë për ta parë atë duke klikuar në zonën përkatëse të diagramit, e cila shfaqet në monitorin e kompjuterit.
Zonat e aplikimit
Citometria e rrjedhës është një metodë universale që përdoret në shumë fusha të mjekësisë dhe shkencës:
- imunologji;
- onkologji;
- transplantologji (transplantimi i palcës së eshtrave të kuqe, qelizave burimore);
- hematologji;
- toksikologji;
- biokimi (matja e aciditetit brenda qelizës, studimi i parametrave të tjerë);
- farmakologji (krijimi i barnave të reja);
- mikrobiologji;
- parazitologji dhe virologji;
- oqeanologjia (studimi i fitoplanktonit për të vlerësuar gjendjen e trupave ujorë dhe detyra të tjera);
- nanoteknologjia dhe analiza e mikrogrimcave.
Imunologji
Sistemi imunitar i njeriut përbëhet nga një shumëllojshmëri e gjerë qelizash. Citometria e rrjedhës në imunologji bën të mundur vlerësimin e strukturës dhe funksioneve të tyre, domethënë kryerjen morfofunksionale.analizë.
Kërkim i tillë ndihmon për të kuptuar natyrën komplekse të imunitetit. Fenotipet e qelizave ndryshojnë si rezultat i aktivizimit nga antigjenet, zhvillimit të patologjive dhe faktorëve të tjerë. Citofluorometria mund të ndajë nënpopullatat e qelizave imune në një përzierje komplekse dhe të vlerësojë të gjitha ndryshimet e tyre me kalimin e kohës.
Onkologji
Një nga detyrat më të rëndësishme në onkologji është diferencimi i qelizave sipas llojit të tyre. Parimi i analizës me citometri të rrjedhës në onkohematologji bazohet në fenomenin e mëposhtëm: kur një mostër trajtohet me një ngjyrë të veçantë fluoreshente, ajo lidhet me proteinat citoplazmike. Pas ndarjes në qelizat në rritje aktive, përmbajtja e tij zvogëlohet përgjysmë. Prandaj, intensiteti i lumineshencës së qelizave zvogëlohet dyfish.
Ka mënyra të tjera për të zbuluar qelizat në rritje:
- përdorimi i ngjyrave që lidhin ADN-në (jodur propidium);
- përdorimi i uracilit të etiketuar;
- regjistrimi i një niveli të rritur të shprehjes së proteinave të ciklinave, të cilat janë të përfshira në rregullimin e ciklit qelizor.
